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錯配修復(fù)基因檢測細(xì)胞衰老
點擊次數(shù)：1062 更新時間：2016-08-08
錯配修復(fù)基因超家族屬于管家基因，目前已發(fā)現(xiàn)人類6個錯配修復(fù)基因：hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2。錯配修復(fù)基因的異常表現(xiàn)為基因突變和蛋白質(zhì)表達(dá)的減步，而蛋白質(zhì)表達(dá)涉及RNA水平和蛋白質(zhì)水平。下面就RNA水平作一簡要闡述。
錯配修復(fù)基因mRNA原位雜交：
【材料】
蓋玻片、濕盒、雜交爐、PBS、SSC、預(yù)雜交液、BcIP／NBT。
【操作程序】
1．將細(xì)胞制成1~107／L細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液一滴接種于已消毒培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，加培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。
2．將細(xì)胞生長狀態(tài)良好的蓋玻片取出0．01mol／L PBS漂洗3次，甲醇：丙酮(1：1)固定液固定10分鐘，PBS漂洗3次。
3．將制好的細(xì)胞片用10mg／ml蛋白酶K消化，37℃，10分鐘，PBS洗2次，每次2分鐘。
4．取200μl預(yù)雜交液95℃變性10分鐘，冰浴中驟冷，加樣于細(xì)胞標(biāo)本上．平放入密封濕盒．42℃孵育3小時。
5．標(biāo)記探針加于200μl預(yù)雜交液中，95℃變性10分鐘，冰浴中驟冷，加樣于細(xì)胞標(biāo)本上，平放入密封濕盒，42℃恒溫過夜。
6．依次用6 xSSC-45％甲酰胺洗10分鐘，2×SSC洗10分鐘×2次，0．2xSSC洗10分鐘×2次。
7．加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，37℃，4小時。
8．洗脫液洗10分鐘，加入BCIP／NBT顯色。鏡檢顯況，PBS沖洗，終止顯色。
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