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如何使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗
點擊次數(shù):752 更新時間:2024-08-19
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗是一個復雜但精確的過程,涉及多個關鍵步驟。以下是一個詳細的實驗流程,旨在指導如何正確使用該試劑盒進行RNA的檢測和定量分析。
一、實驗前準備
1.了解試劑盒信息:首先,仔細閱讀試劑盒的說明書,了解試劑盒的組成、儲存條件、有效期以及實驗所需的設備和試劑。
2.實驗設備和試劑準備:
-熒光定量PCR儀:確保儀器已經(jīng)過校準,并熟悉其操作界面。
-微量移液器、離心機、渦旋振蕩器、分光光度計等實驗設備。
-無RNA酶的離心管、槍頭、EP管等耗材。
-試劑包括RNA提取試劑(如RNAiso Plus)、氯仿、異丙醇、75%乙醇(DEPC水配制)、反轉錄試劑、qPCR反應液等。
二、實驗步驟
1.細胞總RNA提取
1.細胞裂解:對于貼壁細胞,棄去培養(yǎng)液后,用PBS清洗一次,加入適量RNA提取試劑(如RNAiso Plus),吹打均勻后室溫靜置5分鐘。
2.兩相分離:加入適量的氯仿(如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿),劇烈振蕩后室溫靜置5分鐘,然后4℃離心15分鐘(12000G)。此時,混合物將分為三層,RNA主要在水相上層。
3.RNA沉淀:小心吸取上層水相轉移至新的無RNA酶離心管中,加入等體積的異丙醇,混勻后室溫靜置10分鐘,再4℃離心10分鐘(12000G)。此時,RNA將在管底部形成膠狀沉淀。
4.RNA清洗:棄去上清,加入適量的75%乙醇(用DEPC水配制),輕輕上下顛倒混勻,4℃離心5分鐘(7000rpm),重復清洗1-2次。
5.RNA干燥與溶解:小心吸去乙醇,室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘,避免過分干燥。然后加入適量的無RNA酶水溶解RNA,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/span>
2.RNA濃度和純度測定
使用分光光度計測定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光度值,計算RNA的濃度和純度(A260/A280比值應接近2.0)。
3.反轉錄合成cDNA
根據(jù)反轉錄試劑盒的說明書,將RNA反轉錄成cDNA。這通常涉及在RNA溶液中加入反轉錄酶、引物和其他必要組分,然后在適當?shù)臏囟认路跤欢螘r間。
4.qPCR實驗
1.配置qPCR反應液:按照試劑盒說明書,將qPCR反應液的各組分按比例混合,并加入適量的cDNA模板。
2.點板:將配置好的qPCR反應液加入96孔板或八聯(lián)管中,注意避免氣泡和液滴貼壁。
3.上機檢測:將加好樣的孔板或八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀中,設置合適的反應條件(如溫度循環(huán)和熒光信號采集模式),開始實驗。
4.數(shù)據(jù)分析:實驗結束后,收集并分析熒光信號數(shù)據(jù),根據(jù)標準曲線或CT值計算目標基因的相對表達量。
三、注意事項
1.避免污染:整個實驗過程中應嚴格遵循無RNA酶操作原則,防止RNA降解和污染。
2.精確操作:在加樣、離心等步驟中,應精確控制體積和時間,確保實驗結果的可重復性。
3.設備校準:定期對熒光定量PCR儀等實驗設備進行校準和維護,確保儀器的準確性和穩(wěn)定性。
4.儲存條件:試劑盒和試劑應儲存在推薦的溫度下(通常為2-8℃或-20℃),避免光照和反復凍融。
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗需要嚴格遵循實驗步驟和注意事項,以確保實驗結果的準確性和可靠性。
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