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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖分離自臍靜脈血；內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞（Angioblast），是一群具有游走特性，能進(jìn)一步增殖分化的幼稚內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征性表型，不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，其功能主要為參與了出生后缺血組織的血管發(fā)生和血管損傷后的修復(fù)。研究顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，并為缺血性疾病的研究治療提供了新思路，EPCs生物學(xué)特性和治療作用的研究成為這一領(lǐng)域新的熱點(diǎn)。

方法簡介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖采用密度梯度離心、差速貼壁法結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖經(jīng)CD34免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件 PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-2代；不建議多次傳代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠生長分化因子5(GDF5)檢測(cè)試劑盒 ，英文名： GDF5 ELISA Kit

Mouse vitamin K1 (VK1) ELISA Kit 小鼠K1(VK1)檢測(cè)試劑盒

Ratai-spermaibody,AsAbELISAKit 大鼠抗抗體(AsAb)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforHcyELISAKit大鼠同型半胱

細(xì)胞VZV(VARICELLAZOSTER)病毒定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒20次

人高香草酸(HVA)ELISAKit人腺嘌呤二核苷酸0酸(NADPH)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

HA重組甲型流感 H14N5 (A/Mallard/Astrakhan(Gurjev)/263/1982) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

PARP(poly ADP-ribose polymerase 0.5mgPARP(poly ADP-ribose polymerase) 多腺苷二0酸多聚酶抗原

LYN重組人 Lyn Kinase 蛋白 (GST 標(biāo)簽) Protein

CHST11 Protein Human 重組人 CHST11 / C4ST-1 蛋白

BCAM Protein Human 重組人 BCAM 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)

PARP(poly ADP-ribose polymerase 0.5mgPARP(poly ADP-ribose polymerase) 多腺苷二0酸多聚酶抗原

CHST11 Protein Human 重組人 CHST11 / C4ST-1 蛋白

HA重組甲型流感 H14N5 (A/Mallard/Astrakhan(Gurjev)/263/1982) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

BCAM Protein Human 重組人 BCAM 蛋白 (Fc 標(biāo)簽)

LYN重組人 Lyn Kinase 蛋白 (GST 標(biāo)簽) Protein

小鼠酶(CA)ELISA 試劑盒 96T/48T

Human follistatin (FS) ELISA Kit 人卵泡抑素(FS)檢測(cè)試劑盒

Humanglycosylation-dependecelladhesionmolecule-1,GlyCAM-1ELISAKit 人糖基化依賴的細(xì)胞黏附分子(GlyCAM-1)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

DeerEndothelialniicoxidesyhase,eNOS檢測(cè)試劑盒內(nèi)皮型合成酶(eNOS)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

載玻片細(xì)胞鈣交換體(NCX)蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒10/20次

MouseEndothelin1,ET-1ELISAKit小鼠內(nèi)皮素1(ET-1)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

人臍靜脈血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞小鼠酸性粒細(xì)胞趨化因子檢測(cè)試劑盒   小鼠酸性粒細(xì)胞趨化因子試劑盒   規(guī)格型號(hào)：96T/48T   小鼠酸性粒細(xì)胞趨化因子試劑盒，規(guī)格型號(hào)：96T/48T，來源：檢測(cè)試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠酸性粒細(xì)胞趨化因子試劑盒、小鼠酸性粒細(xì)胞趨化因子eisa試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個(gè)月。

小鼠小扁結(jié)合型甲胎蛋白檢測(cè)試劑盒   小鼠小扁結(jié)合型甲胎蛋白試劑盒   規(guī)格型號(hào)：96T/48T   小鼠小扁結(jié)合型甲胎蛋白試劑盒，規(guī)格型號(hào)：96T/48T，來源：檢測(cè)試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠小扁結(jié)合型甲胎蛋白試劑盒、小鼠小扁結(jié)合型甲胎蛋白eisa試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個(gè)月。

小鼠表皮調(diào)節(jié)素檢測(cè)試劑盒   小鼠表皮調(diào)節(jié)素試劑盒   規(guī)格型號(hào)：96T/48T   小鼠表皮調(diào)節(jié)素試劑盒，規(guī)格型號(hào)：96T/48T，來源：檢測(cè)試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：小鼠表皮調(diào)節(jié)素試劑盒、小鼠表皮調(diào)節(jié)素eisa試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個(gè)月。

豚鼠神經(jīng)肽A檢測(cè)試劑盒   豚鼠神經(jīng)肽A試劑盒   規(guī)格型號(hào)：96T/48T   豚鼠神經(jīng)肽A試劑盒，規(guī)格型號(hào)：96T/48T，來源：檢測(cè)試劑盒（進(jìn)口分裝），產(chǎn)品別名：豚鼠神經(jīng)肽A試劑盒、豚鼠神經(jīng)肽Aeisa試劑盒   保存條件：2-8℃   保質(zhì)期：6個(gè)月。